ケミカルバイオロジー・標的同定
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求電子剤優先スクリーニングでE2酵素UBE2D2の共有結合型アミノチアゾール阻害剤を同定
- 求電子剤を先に選ぶスクリーニングとX線結晶構造解析により、UBE2D2の2つのシステイン(C85とC111)に結合する共有結合性ヒットを得た。
- アミド基とエステル基を構造に基づいて改変し、C111への結合を消してC85への親和性を高めた。
- 最適化類縁体はUBE2D2の酵素活性を阻害し、A549肺がん細胞の増殖を抑えた。
E2酵素は創薬困難と見なされてきたので、結晶構造に裏づけられた共有結合シリーズが出てきたこと自体が前進だ。注目は2つ目のシステインへの結合を設計で消した点で、プローブと呼ぶには必須の作業である。次に知りたいのはUBE2Dファミリーの他メンバーへの挙動で、活性中心システインは保存されているため、選択性が最大の難所になる。
PROTACの標的結合のばらつきは、E3認識よりも細胞内曝露の差が大きい
- E3リガンド、リンカー、標的リガンドが異なる20種のPROTACを、セレブロンおよびVHLトレーサーに対する細胞内NanoBRET競合アッセイで評価した。
- 添加濃度基準では見かけの活性が大きくばらつき、受動的なCaco-2透過性ではほとんど説明できなかった。
- 実測した細胞内非結合型曝露で補正するとばらつきは大幅に縮小し、膜透過処理した細胞での値と一致した。
PROTACのSAR表をE3親和性の差として読む前に、細胞が実際に見た濃度を確かめたくなる。ばらつきの大半が非結合型曝露なら、活性向上に見えたリンカー修飾は透過性の改善にすぎないかもしれない。曝露を早期に測れば、見当違いの変数を追わずに済む。
セレブロンの潜在Cys287を狙う共有結合リガンドがE3リガーゼを開状態に固定し、IMiD駆動の分解を阻止
- システイン指向のケモプロテオミクススクリーニングで、サリドマイド結合部位から離れたアロステリックポケットCys287に結合する共有結合リガンドを同定した。
- リード化合物VVD-105917は、IMiDやCELMoDによるネオ基質の分解を広く阻害する。
- クライオ電顕で、セレブロンを開いた不活性型に固定することが示され、リガンド添加順序にも依存する。同部位の既報リガンドは逆に閉鎖を促進するため、このポケットは作用が反転しうる。
これまでのCRBN薬は全て単一のオルソステリックポケットに結合するため、開閉スイッチを制御する共有結合ハンドルは本当に新しいつまみだ。パン阻害薬は分解薬の機序解析やオフターゲット分解のレスキューに優れたツールになる。どちらにも振れる部位ということは、分解を高めるリガンドが同じポケットに潜む可能性もある。プレプリントなので査読を待ちたい。
Allosteric covalent inhibition of cereblon through cryptic cysteine targeting ↗
マッチした陰性対照つきの5-アザインドール系TTBK1/2プローブ、繊毛形成を阻害
- 5-アザインドール系化合物13は、タウチューブリンキナーゼ1・2に強力かつ細胞活性を示す。
- 細胞内キノーム全域の解析でオフターゲットは限定的で、NanoBRETによる追試でCDK11A/B、CK1δ、PIKfyveに絞り込まれた。
- 構造の近い化合物5は細胞内でTTBKに結合せず陰性対照として機能し、化合物13はTTBK2の自己リン酸化とRPE-1細胞の一次繊毛形成を阻害した。
評価したいのは姿勢の良さだ。細胞内キノーム選択性マップ、CDK11やPIKfyveの弱点の率直な開示、構造が近い不活性対照が揃っている。繊毛形成の表現型に生物学的意味を読む前に、プローブはこうあるべきだ。まず試したいのはCDK11の重なりで、別骨格のプローブで検証したい。
Potent and Cell Active 5-Azaindole-based Tau Tubulin Kinase Inhibitors Disrupt Ciliogenesis ↗
ElevenostatはHDAC11選択的プローブではなく、HDAC6に偏る多重HDAC阻害薬だった
- Elevenostat(JB3-22)を組換えHDACアイソフォームと2種類の直交的HDAC11アッセイで再評価したところ、HDAC11阻害は弱かった。
- HDAC1〜11の全パネルでは、HDAC6とHDAC10およびクラスI酵素への阻害がはるかに強く、HDAC11が最も感受性の低いアイソフォームだった。
- 細胞内でもチューブリンやヒストンのアセチル化上昇と生存率低下が見られ、HDAC6とクラスIの関与と整合するため、この化合物に基づく過去のHDAC11の結論は再解釈が必要だ。
地味だが価値の高い論文だ。HDAC11のツールとして使われてきた化合物が、実はHDAC6に最も強く効く。Elevenostatで報告された表現型は、すべて帰属の見直しが必要になる。阻害薬をプローブとして使う前には、全パネルでの選択性と対照となる不活性化合物が要るという教訓でもある。
シアノキノリン系HIPK4阻害薬、非ホルモン性の男性避妊薬への道
- HIPK4は精子細胞に特異的で精子頭部の形成に必要なキナーゼであり、非ホルモン性避妊薬の標的候補である。
- シアノキノリン系の化合物群は、HIPKファミリー内でもキノーム全体でも選択的な強力HIPK4阻害薬となった。
- 一部の化合物は精子細胞でHIPK4の恒常性も変え、不溶性凝集体を形成させてオートファジー受容体TAX1BP1との相互作用を促した。
初期の化合物群でキノーム全体の選択性が出ているのはプローブとして理想的だ。予想外のタンパク質恒常性への作用は、調節可能な分解型に近い作用様式を示唆していて興味深い。ただ避妊薬としては、可逆性と長期安全性の証明という非常に高い壁が残る。
Small-Molecule Modulators of HIPK4 Activity and Proteostasis ↗
アジド導入VEGFR2阻害薬、網膜に届く緑色光で活性が上昇
- アジド基を導入したVEGFR2阻害薬EYE1090とEYE1118は、暗所でも強い阻害活性を保ちつつ、光照射で受容体への結合が促進されます。
- 高齢者の網膜にも届く緑色光で、in vitroの血管新生抑制活性が高まりました。
- 経口投与で、ラットのVEGF誘発網膜漏出を抑え、マウスの脈絡膜新生血管モデルで病変を縮小し、急性肝毒性は見られませんでした。
光スイッチにアジドを使うのは、古典的なキナーゼ骨格への小さく巧みな修飾です。魅力は空間選択性で、全身曝露しつつ光が集まる眼内でだけ活性が高まります。暗所活性がどこまで残るか（眼以外でのVEGFR2オフターゲット作用に直結します）と、光反応生成物の行方を確かめたいところです。
Three Nitrogen Atoms Turn Old Kinase Inhibitors Into New Targetable Remedy ↗
アザフィロンプローブが、生きた細菌のプロテオームで反応性リジンを網羅的にマッピング
- 天然物スクレロチオリン由来の簡略化アザフィロン「SCL-alkyne」を、細菌でリジン反応性をプロテオーム規模で解析するために設計した。
- in vitroでも生きた大腸菌でもリジン選択性が高く、結合部位の大半はリジンかタンパク質N末端だった。反応性リジンのうち機能領域にあるのはごく一部にとどまった。
- 濃縮解析から細菌の走化性が主要な標的経路として浮かび、その後確認された。
共有結合リガンド探索はシステイン中心で、スルホニルフルオリドや活性エステル以外のリジン指向スキャフォールドは乏しいため、天然物由来の選択肢は魅力的だ。反応性リジンの多くは機能領域にないという知見は、反応性は安く機能は安くないという戒めになる。大腸菌でのプレプリントなので、リードではなく共有結合フラグメントの出発点と見るべきだ。
NanoBRETアッセイがp53 Y220Cリガンドの生細胞内標的結合を検証
- 研究チームは、報告されているp53 Y220Cリガンドが生細胞内で実際に変異体タンパク質に結合するかを検証するため、生細胞NanoBRETアッセイを構築した。
- このBRETベースの読み出しにより、既知のY220C安定化・再活性化化合物について細胞内での標的結合の強さを比較でき、従来の生化学的結合データを補完する。
- こうした細胞内での検証は、膜透過性と細胞内での標的占有率を確認するものであり、創薬が難しいこのp53キャビティ変異体において、ヒットからリードへ進める重要な関門となる。
DSFやITCでは見栄えの良い結合を示す化合物でも、あの埋没した極性キャビティへ膜を越えて到達する段階でしばしば頓挫する——細胞内BRETランキングは、Y220Cのヒット化合物をSARに進める前に、まさにその失敗パターンを見抜くために設計されたものだ。とはいえ、p21誘導やアポトーシスといった機能的な読み出しと突き合わせ、rezatapopt(PC14586)の細胞内エンゲージメント幅と直接比較するまでは、このランキングを生化学的Kdより信頼する気にはまだなれない。
NanoBRET Target Engagement Enables Validation of p53 Y220C Ligands in a Cellular Context ↗
リンカー化学の改良でsiRNA抗体複合体の送達効率が向上
- 新たなbioRxivプレプリントは、抗体オリゴヌクレオチド複合体(AOC)の化学的構造がsiRNA送達担体としての性能にどう影響するかを検討した。
- 本研究では、リンカーの組成、抗体上のコンジュゲーション部位、siRNAの化学修飾パターンといった設計変数を検討している。
- 得られた知見は、どの構造的選択がノックダウン活性と送達効率に最も影響するかを明らかにし、合理的なAOC設計に役立つことを目指している。
AOC化学者がADCで培った結合部位制御とリンカー安定性のノウハウをそのまま移植できるのか、それともオリゴペイロードには独自のルールが必要なのか——これはsiRNAペイロードそのものより重要な論点だ。DARと結合部位特異性を固めることこそ、AOCをGalNAcコンジュゲートには成し得ない肝外送達の答えにする鍵であり、まさにそれゆえAlnylamやAvidityをはじめ各社がこの化学を先に押さえようと競っている。
Enhancing the efficacy of siRNA Antibody Oligonucleotide Conjugates (AOCs) through chemical design ↗
新たな選択的HDAC4/HDAC7阻害剤、Th17生物学の化学プローブとして登場
- HDAC4とHDAC7は、発現が限定的なクラスIIaヒストン脱アセチル化酵素であり、それぞれ異なる転写機構を介してTh17細胞の分化を促進する重要な制御因子であることが近年明らかになった。
- 研究チームは、クラスIIaスキャフォールドであるTMP269を出発点として、選択的なHDAC4/7阻害剤の新規シリーズを設計・合成した。
- 金属結合部位近傍および疎水性結合領域を対象とした構造に基づく最適化により、効力が向上し、アイソフォーム選択性がより高いアナログが得られた。
- ルシフェラーゼ転写アッセイ、タンパク質結合実験、分子ドッキング解析により、HDAC4とHDAC7それぞれの選択性を規定する異なる構造活性相関が明らかになった。
- 得られた化合物は、Th17生物学におけるHDAC4とHDAC7の個別機能を解明するための化学プローブとなり、炎症性腸疾患(IBD)などTh17が関与する炎症性疾患を標的とした治療薬開発の基盤となる。
クラスIIaのHDACは擬似触媒的で、浅く緩いポケットを持つ厄介な酵素だ。TMP269を出発点にすれば、クラスI/IIbに対する選択性はほぼノーコストで手に入る――本当の勝負はその先、HDAC4とHDAC7を弁別できるかどうかだ。 この二つの触媒ドメインはほぼ同一なので、選択性は亜鉛結合基ではなく、疎水性チャネル内のセカンドシェル/リム残基との接触から生まれるはずだ。だからこそ、金属配位を担うSARと選択性を決めるSARを切り分けるという今回のアプローチは理にかなっているが、実行は決して容易ではない。 プローブとしての完成度は高いと感じる――Th17の表現型をきれいに切り分けるには、効力とパラログ識別能の両立が不可欠だからだ。とはいえ、細胞アッセイの結果を鵜呑みにする前に、膜透過性やオフターゲットのデータは確認しておきたい。 がん領域が主戦場だったHDAC阻害剤開発の中で、Th17/IBDに照準を合わせたのは賢い選択だと思う。汎HDAC阻害の毒性は慢性投与では致命的であり、アイソフォーム限定の作用機序こそが、忍容性のある慢性免疫調節薬に至る唯一現実的な道だろう。
研究者、Th17細胞の転写を調節する選択的HDAC4・HDAC7阻害剤を開発
- HDAC4とHDAC7は発現が限られたクラスIIaヒストン脱アセチル化酵素であり、広く発現する他のHDACファミリーよりも選択性の高いエピジェネティック標的となり得る。
- 両酵素はTh17細胞分化を駆動する転写プログラムに関与し、この経路は炎症性腸疾患やその他のTh17関連炎症性疾患と関連している。
- 研究チームは既知のクラスIIaスキャフォールドであるTMP269の金属結合領域と疎水性接触領域を改変し、HDAC4/7を標的とする新規誘導体シリーズを構築した。
- レポーター遺伝子アッセイ、結合試験、およびドッキング解析により、HDAC4とHDAC7への選択性をそれぞれ左右する異なる構造的特徴が明らかになった。
- この研究により、HDAC4とHDAC7の機能を個別に解析するための選択的かつ強力な化学プローブ、さらにはTh17を標的とした治療薬開発の出発点となる化合物が得られた。
クラスIIa HDACは一族の中でも変わり者で、本質的な脱アセチル化活性がほとんどなく、機能の多くはきれいな触媒ポケットよりタンパク質間の接触に依存している——だから汎用的なHDAC薬理基団では選択性が出にくい。ゼロから設計せずTMP269を出発点にしたのは現実的な判断だ。実証済みのクラスIIaバインダーを金属結合ウォーヘッドと隣接する疎水性接触部位でチューニングする方が、盲目的な探索よりはるかに着手しやすいSAR課題になる。そこからHDAC4とHDAC7の選択性を引き出せたのが本当の収穫で、両者は相同性が高くきれいな分離が難しいことで知られている。臨床のHDAC阻害剤の大半はパンあるいはクラスI選択的なので、アイソフォーム純度の高いクラスIIaプローブは、リード化合物を云々する前段階でTh17生物学を解剖するための実用的なツール化合物として本当に価値がある。
光架橋プローブがTRIM24ブロモドメインの新規非ヒストン結合パートナーを解明
- TRIM24は、アセチル化ヒストンに結合するブロモドメインを持つデュアル型エピジェネティック「リーダー」タンパク質であり、がん治療の標的として確立されているが、ヒストン以外の結合パートナーはこれまで十分に解明されていなかった。
- 研究チームは、遺伝子コード型光架橋アミノ酸AzFとBzFをブロモドメインのアセチルリジン結合ポケット内のL922残基に導入し、ヒストン認識能を保持したままUV照射による相互作用タンパク質の共有結合的捕捉を可能にした。
- 定量プロテオミクス解析により、AzFプローブで濃縮されたNPM1、BzFプローブで濃縮されたCDK9という2つの非ヒストンタンパク質が同定され、さらにMAP4、RAN、SND1も候補として挙がった。
- ChIP-seq解析では、TRIM24、CDK9、NPM1ががん関連遺伝子の転写開始点付近で共局在することが示され、KEGG解析により同定タンパク質が複数のシグナル伝達経路に関与することが示された。
- この手法は、光架橋技術がリーダードメインのインタラクトーム解析をヒストン以外にも拡張できることを示し、TRIM24を標的とした化学プローブおよび薬剤開発のための新たな候補を提供する。
「選択的ブロモドメイン阻害剤」の定義が一段と厳しくなった。NPM1とCDK9が、TRIM24のブロモドメインプローブやデグレーダーが結合するのと同じ場所——アセチルリジンポケットのL922——に居合わせていたからだ。つまり選択性は、他のBRDファミリーとの選択性だけでなく、これらの非ヒストン結合を外さない選択性も意味することになる。従来のブロモドメイン創薬は基本的にこのポケットを標的にした構造ベースでヒストン模倣ポテンシャルを追う一本道だったが、今回の結果はそのポケットの生物学がヒストンの外まで広がっていることを示しており、TRIM24プローブの細胞表現型がヒストンリーディングではなくNPM1/CDK9の阻害由来かもしれないという懸念が出てくる。とはいえこれは化合物ではなく架橋剤によるターゲット同定ツールに過ぎない。MAP4、RAN、SND1はプロテオミクスリストに載った「候補」であって確定した相互作用ではないので、SARの物語を組む前にco-IPやFPでの追加検証、用量依存的な競合実験を見たい。
二官能性ピリジンリンカーによる逐次的・安定なバイオコンジュゲーション技術
- チアントレニウム脱離基とフッ素官能基を単一のピリジン骨格に組み込むことで、アルキルアミン、続いてシステインチオールという2段階の化学選択的カップリングが可能になった。
- 生成するアリール-システイン結合は非キラルで安定であり、可逆的な結合や立体化学的な不均一性といった既存のバイオコンジュゲーション手法の課題を解決する。
- 両方のカップリング段階で高い官能基許容性と化学選択性を示し、複雑なペプチドやタンパク質にも適用可能である。
- このプラットフォームは、後期段階でのペプチド多様化やステープリング、部位選択的なタンパク質修飾に応用された。
- さらに、HER2標的抗体薬物複合体(ADC)MRG002のアナログを薬物抗体比を調整可能な形で構築し、従来のリンカー化学と比べて血清中でのペイロード保持性が向上することが示された。
マレイミド-システイン結合の弱点は今さら言うまでもない——レトロマイケル反応でペイロードが血中に漏れ出し、DARもスペック通りには安定しない。今回のピリジン/チアントレニウム二官能性骨格はそこを正面から突いている。生成するアリールチオエーテルは非キラルかつ加水分解に強く、ジアステレオマー混合物にも血清チオールとのリンカー交換にも悩まされない。 アミンカップリングを先に、システインを後に、同一のハンドルから逐次的に化学選択的に行える点は、単なるNHSエステル化学の焼き直しではなく、直交的なペイロード/タグ導入にとって実用的な前進だ。 注目すべきは、ペプチドステープリングのデモで終わらせず、MRG002のHER2 ADCアナログをDAR調整可能な形で構築し、従来のリンカー化学より血清中ペイロード保持性が向上したことを示した点——これはアカデミックな興味の域を脱し、実際に試してみたくなる根拠になる。チアントレニウム試薬のスケールアップとコストが、GMPラインでマレイミドを置き換えられるかどうかを左右するだろう。
新規分子グルー分解剤がWBP4を標的に、分解タグ基盤「wTAG」を確立
- スプライソソーム関連の足場タンパク質WBP4は、これまで低分子による標的化が困難とされてきたが、これを選択的に分解するファーストインクラスの分子グルー分解剤「dWBP4-1」が同定された。
- この化合物はCRBN E3リガーゼを介して作用し、典型的なGループ界面を通じてWBP4に結合することで、迅速かつ高い効力での分解を誘導する。
- プロテオーム全体を対象とした解析では、この分解剤が高い選択性を示し、遺伝子発現やスプライシングパターンへの副次的な影響はごくわずかであることが確認された。
- 研究チームはWBP4のわずか41アミノ酸からなる領域が分解タグとして機能するのに十分であることを突き止め、この化学遺伝学的システムを「wTAG」と命名した。
- wTAGを他の標的タンパク質に融合させると、多くの分解ツールで問題となる「フック効果」を伴わずに、明確で用量依存的な分解が可能となり、汎用的な研究基盤としての可能性が広がった。
WBP4はリガンド結合ポケットを持たないスプライソソームの足場タンパク質——キナーゼにデグロン尾部を足しただけの話ではなく、G-loop接点を介してCRBNを本当に「創薬不可能」な表面に誘導できることの証明だ。この結合仮説は、自分の手元にある難標的候補の選別リストに転用したくなる。 選択性データこそ本当の見どころだ。プロテオーム全体でクリーンな一方、スプライシングへの攪乱も最小限——これはグルー分子が最もつまずきやすいポイント(ネオ基質の乱雑さ、RBM39型の隠れたスプライシング副作用)そのものだ。両方を同時に達成しているのは珍しい。 wTAGは分解剤本体より重要かもしれない。41残基のポータブルなデグロンでフック効果もない——これはdTAG系よりもクリーンなツールで、単発の標的リードより自分のアッセイツールボックスに欲しい代物だ。
小胞体標的近赤外プローブによりhCES2A阻害剤の迅速な発見を実現
- 近赤外蛍光プローブPA-HDCIは、HDCI骨格を基盤とし、小胞体(ER)に局在するよう設計されており、生細胞や動物内でヒトカルボキシルエステラーゼ2A(hCES2A)の活性をリアルタイムに検出できる。
- PA-HDCIは大きなストークスシフト、高い代謝安定性、確実なER標的性を兼ね備えており、多様な生物学的システムにおいてhCES2A機能のその場イメージングを可能にする。
- PA-HDCIを用いたハイスループットスクリーニングにより、hCES2Aに対する強力な共有結合型阻害剤である化合物A4が同定された。
- hCES2Aは、抗がん剤イリノテカンを毒性のある活性代謝物に変換する腸内酵素であり、イリノテカン誘発性腸管毒性(IIT)の原因となる。
- 担がんマウスモデルにおいて、A4は良好な安全性プロファイルを示し、有効性を維持しながらイリノテカンに関連する腸管毒性を軽減した。
- 本研究は、新たなイメージングツールとhCES2A標的薬発見のための検証済みプラットフォームの両方を提供するものである。
見どころはまずプローブ設計そのもの。HDCI骨格からER選択的局在と大きなストークスシフトを引き出しており、単なる蛍光試薬ではなく、細胞内でも破綻しないフォトフィジックスを実現した設計の妙がある。 本当の価値は方法論的な転換にある。機序解析用のイメージングツールがそのままHTS読み出しとして機能し、hCES2A活性を生細胞・生体内でスクリーニング可能な表現型に変換した点は、生化学アッセイと細胞内実態との乖離を埋める。 標的そのものは目新しくない。hCES2Aはイリノテカンを腸毒性代謝物へと活性化するオフターゲット酵素として既知であり、新規メカニズムの開拓というより「副作用を潰す」タイプの創薬だ。 A4はHTS由来の共有結合型ヒットで、マウスでの安全性データは有望だが、反応性プロファイリング、エステラーゼファミリー全体での選択性評価、SAR展開といった共有結合ヒットの定石的な検証はこれから。
機械学習による500万候補のスクリーニングで光活性化PARP1阻害剤を創出
- タンパク質–リガンドドッキング、ML力場、量子化学計算、自由エネルギー摂動(FEP)を組み合わせ、光活性型PARP1リガンド候補約500万種をスクリーニング。
- ドッキングにより光照射下と暗所下でPARP1への結合が異なる候補を特定。ML力場とQM計算でpKa、吸収スペクトル、熱半減期を予測し、グラフベースの代理モデルで残りのライブラリをスクリーニング。
- 励起状態の非断熱動力学シミュレーション(ML力場を利用)により光スイッチングの量子収率を推定。FEPで上位候補の結合親和性予測を精緻化。
- レッドシフトした吸収波長(組織透過性に有利)、治療応用に適した熱半減期、光/暗所選択的なPARP1結合を兼ね備えた、合成的に実現可能な候補を少数厳選。
- 予測は実験的に検証され、光活性化(フォトファーマコロジー)がん治療薬設計における計算から実験までの一貫したパイプラインを実証。
500万件の仮想候補をひと握りまで絞り込んだファネル(ドッキング→ML力場→量子化学→非断熱ダイナミクス→FEP)こそが今回の見どころで、これはメドケムチームがこれまで手作業のSAR勘に頼っていた作業を、人間が手を出せないほど広いケミカルスペースで高速に肩代わりしている。結合様式の仮説はシンプルで、(おそらく)ニコチンアミド模倣型のPARP1ファーマコフォアにフォトスイッチを付加し、明状態と暗状態の異性体間でポケット占有を切り替える構造だ。つまりここでの「選択性」はPARP2やタンキラーゼに対するアイソフォーム選択性ではなく、腫瘍組織内での時空間的な制御を指しており、オラパリブやニラパリブが最適化してきた軸とはまったく別物だ。組織透過性のための赤方偏移吸収と、治療に使える熱半減期の両立は、フォトファーマコロジーのリード化合物をこれまで頓挫させてきたトラクタビリティの壁であり、合成的にアクセス可能な化合物でその両方をクリアし、さらにウェットラボで検証まで漕ぎ着けた点こそが本当に注目に値する。
Computational Design and Experimental Validation of Photoactive PARP1 Inhibitors ↗
反応性金属スキャフォールドでプロテオーム規模のシステインをマッピング、PRMT1阻害を発見
- 反応性メタロスキャフォールド(r-mS)という新概念を提唱。クロロアセトアミド型の求電子ワーファーを持つ共有結合性金属錯体で、プロテオーム全体のリガンド化可能なシステインを標的とする。
- HEK293T細胞溶解液を用いたケモプロテオミクス解析により、絞り込んだr-mSシリーズのシステイン結合をプロテオーム規模でマッピングし、新規の結合部位を同定。
- 金属種、アレーン置換基、分子全体の立体構造が組み合わさってシステイン反応性と標的選択性を決定づけることを示した。
- リード化合物r-mS-2はメチル基転移酵素PRMT1のSAM結合ドメイン内の機能上重要なシステインに結合し、インタクトタンパク質LC-MSでこれを確認。
- この結合がPRMT1活性を機能的に阻害することを実証し、共有結合ヒットを検証済み標的の機能調節に直結させた。
- 次世代メタロドラッグの合理的設計に向けた、汎用的な標的探索プラットフォームとして位置づけられる。
SAM結合ポケット内のシステインを直接叩いている点が、今回いちばん信頼できるところだ——活性測定だけでなく、インタクトタンパク質LC-MSで占有を確認しているのは妥当な基準だと思う。慎重になりたいのは選択性の方で、金属種とアレーン置換基で反応性を調整できるのは面白いレバーだが、ヨードアセトアミド/クロロアセトアミド系のフラグメントライブラリがすでに抱えている変数にもう一つ加わる話で、ライセート内スクリーニングだけでは細胞内でのオフターゲットCys負荷は見えてこない。化学的には、我々の多くにとって本当に不慣れな領域だ——配位子交換、酸化還元不安定性、バッチ間再現性は、有機ワーヘッドにはない負債になる。既存のシステイン標的ケモプロテオミクス基盤と比べると、r-mSは興味深い第三の調整軸を加えるものであって、まだ明確な優位性とは言えない。金属薬剤全般としても、有機低分子と比べたこの扱いにくさは変わらず——注目には値するが、まだ手を伸ばす段階ではない。
光架橋プローブがTRIM24ブロモドメインの非ヒストン相互作用相手を解明
- 遺伝暗号拡張技術を用いて、TRIM24ブロモドメインのアセチルリジン結合ポケット内のL922残基に、部位特異的な光架橋基AzFとBzFを導入した。
- 両プローブともアセチル化ヒストンの認識能を保持し、UV照射下で効率よく架橋を形成、相互作用ベースのタンパク質プロファイリング(IBPP)を可能にした。
- 2種の相補的プローブによる定量プロテオミクスでは捕捉プロファイルが異なり、AzFではNPM1、BzFではCDK9が濃縮ヒットとして同定され、MAP4、RAN、SND1も候補として挙がった。
- ChIP-seq解析により、TRIM24、CDK9、NPM1ががん関連遺伝子の転写開始点付近で重なって局在することが示された。
- これらの結果は、TRIM24ブロモドメインがヒストンだけでなく非ヒストンタンパク質のアセチル化も認識することを示唆し、リーダーとしての機能範囲の広がりと、このポケットを狙うケミカルプローブ設計への手がかりを与える。
クロスリンカーがL922、つまりアセチルリジン結合ポケットの中に収まっているという事実そのものが重要だ——単なる表面での偶発的な接触ではなく、TRIM24がヒストンと同じポケットを使ってNPM1やCDK9上のアセチル化リジンを認識している証拠と見るべきだろう。これはTRIM24を「アセチルリジンリーダー」としてより広い基質特異性を持つ分子として再定義するもので、このポケットを狙う阻害剤は同時に非ヒストン標的とも競合していることになる。実務的には、TRIM24プローブ開発ではNPM1/CDK9への結合を確認するカウンタースクリーニングが必須になったということだ。ChIP-seqでのTSS付近の共局在は、このオフターゲット結合が単なるバックグラウンドノイズではなく転写制御に関与している可能性を示唆している。なお本論文は遺伝暗号拡張によるインタラクトーム解析であり、メディシナルケミストリーの論文ではない点は注意したい——ケミオタイプもSARも示されておらず、あくまでポケット指向プローブが何に当たるかの地図にすぎない。BET阻害剤の分野は非ヒストンアセチルリジン基質という同じ教訓をすでに経験しており、TRIM24はようやくその複雑さに追いついてきたところだ。
ティデグルシブ、新規共有結合機構によりNatAアセチル基転移酵素の初のケミカルプローブとして同定
- NatA(Nα末端アセチル基転移酵素A)は真核生物のNα-アセチル化の大部分を触媒し、タンパク質の安定性・局在・機能に重要な翻訳共役修飾だが、これまで検証されたNatA用低分子プローブは報告されていなかった。
- 社内約700化合物ライブラリのスクリーニングとチアジアゾリジンジオン骨格の構造最適化により、臨床段階のGSK-3β阻害剤であるティデグルシブ(YD3139)がヒットとして同定され、既知薬剤がNatAへ転用された。
- 機構解析により、ティデグルシブはまずNatAにアロステリックに結合し、その後触媒反応で遊離したCoAが化合物を化学修飾して可逆的な共有結合付加物を形成するという、これまで報告されていない触媒依存的阻害機構であることが示された。
- 本化合物は酵母およびヒトNatAに対して低マイクロモル濃度の活性を示し、他のNATファミリーに対する良好な選択性を有していた。酵母細胞内プロテオミクスによりオンターゲット活性が確認され、機構的ケミカルプローブとして検証された。
特筆すべきはその機構だ。酵素自身の触媒サイクルがCoAを放出するまで非共有結合のまま待つアロステリック結合剤——単なる新しい反応性基ではなく、本当に新しい仕掛けだ。NatA特有のCoA放出化学を超えて一般化できるかは不明だが、他のCoA依存性・コファクター依存性酵素へのテンプレートとして記憶しておく価値がある。保存された活性部位を持つにもかかわらず他のNATファミリーに対して選択性が良いという点は、もっと実用的な教訓だ。触媒ポケットを避けてアロステリック部位を狙えば、保存性の問題を回避できる。プローブ探索としては、tideglusibの転用はデノボ合成より速いが、既存のGSK-3βデータセットすべてが交絡することも意味する——新しい化学構造なしにtideglusibの表現型からNatA生物学を読み取るべきではない。NatA自体は正当で未開拓の標的に見える。これはプローブ論文であり薬剤論文ではないが、正しい第一歩だ。
ダイレクト・トゥ・バイオロジー戦略で選択的GRP78阻害剤を開発
- GRP78(BiP/HSPA5)は保存性の高いHSP70ファミリーに属するシャペロンであり、アイソフォーム選択的な阻害剤の設計は困難とされてきた。
- 研究チームはダイレクト・トゥ・バイオロジー(D2B)戦略——中間精製を行わず合成から生物学的スクリーニングへ直結させる手法——を用い、選択的GRP78阻害剤として化合物12を同定した。
- 化合物12はGRP78の基質結合ドメイン内のペプチド結合ポケットに結合し、他の試験対象HSP70アイソフォームに対して選択性を示す。
- A549肺がん細胞を強力かつ選択的に死滅させる一方、他の試験対象肺がん細胞株にはほとんど影響を与えなかった。
- 細胞熱シフトアッセイ(CETSA)により細胞内でのGRP78への結合が確認され、GRP78関連の小胞体ストレス応答(UPR)シグナルを調節することも示された。
- 著者らは化合物12を、GRP78生物学を解明するためのケミカルプローブ、およびGRP78標的治療薬開発の出発点として位置づけている。
基質結合ドメイン、しかもATPaseポケットではない――難易度は高いが、選択性を狙うなら理にかなった標的だ。HSP70ファミリーのプログラムの大半はヌクレオチド部位を狙い、その交差反応性の問題をそのまま引き継いでしまう。ペプチド結合溝からGRP78選択性を引き出せたのは、正真正銘の創薬化学の成果だ――あの手のポケットは浅く、構造的に乱雑な結合を許しやすい。次に見たいのはD2Bから得られたSARの流れだ。粗製プレートのヒットから一気にCETSAでの結合確認まで進むのは速いが、未精製の反応液由来の効力値を信じる前に、クリーンな再合成と用量反応曲線を確認したい。とはいえA549選択的な殺細胞活性を持つプローブ級の出発点として、化合物12はATPase部位狙いの二番煎じではなく、最適化を続ける価値のある正当なテンプレートだ。
Development of Isoform-Selective GRP78 Inhibitors from a Direct-to-Biology Strategy ↗
新たなコンジュゲート化学、エンドサイトーシスを介さず標的結合時に薬物を放出
- 研究チームは、受容体を介したエンドサイトーシスに頼らず、薬物コンジュゲートが標的に結合した時点で直接ペイロードを放出する「結合誘導放出(BTR)」戦略を報告した。
- この手法では、SuFExクリックケミストリーに着想を得た新しいバイオコンジュゲーション反応「リン(V)-フェノール交換(PhoPEx)」を用いる。これはコンジュゲートが標的に結合すると、結合ポケット内の化学反応そのものが薬物を切り離す仕組みだ。
- 効率的なエンドサイトーシスが可能な創薬標的はごく一部に限られるため、この結合誘導型の放出機構は、内在化しにくい標的にもコンジュゲート型治療薬を応用できる可能性がある。
- 著者らは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を標的としたコンジュゲートを用いた概念実証研究を報告しており、in vitro実験から患者由来組織検体に至るまで評価を行った。
巧妙なのはトポロジー的な設計だ。P(V)中心に十分近い位置に求核性残基(Ser/Tyr/Lysなど)がポケット内に存在して初めて成立する仕組みなので、標的ごとにポケット形状が協力的かどうかに依存する——万能な解決策ではなく、標的ごとの個別設計課題に近い。SuFExはバイオオルソゴナルなクリック化学のプラットフォームとして成立するほどの頑健性を証明したが、PhoPExの放出速度論や選択性がFAP以外でも通用するかは本当の未解決点だ。患者組織での概念実証は有望だが、まだ1標的の話にすぎない。気に入っているのは、放出をエンドサイトーシスとリソソーム処理から完全に切り離せる点で、これはGPCRや一部イオンチャネル、FAPのような間質マーカーなど、内在化しない・輸送が遅い表面受容体に対する既存ADC型アプローチの実際のボトルネックだ。このケミストリーが一般化できれば、単なるリンカーの改良ではなく、コンジュゲートで狙える標的空間の本質的な拡張になる。
A binding-to-release strategy for targeted anticancer drug delivery ↗